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接着上次的再写点吧，毕竟这样可以帮助整理一下自己的思路。

发现virus可以把相关的基因带入染色体并可以稳定遗传给下一代，这对ES种质性的modification是个big good news。但是，还是要解决一些关于基因整合的特异性问题。如果引入的外源基因是randomly insertion,那就是transgenic技术，应用非常有限并且可能存在非常多的uncertainty。比如可能导致正常染色体区域的中断，这些都是实现应用的重大问题。

这个时候，另外两位诺贝尔奖获得者的工作重要性就出来了。 Capecchi以及Oliver Smithies非常重要的贡献就是解决了特异性的基因修饰的问题。这时，之前在细菌里得到的基因重组的理论显示其powerful的aspect。下面会讲到这一点。

so,科学的研究都是前仆后继的，听到的一个说法是，上帝因人类始祖犯罪把永生从他们身上夺去，但是人类依靠文明的传承将整个历史串联起来，似乎在另外一种意义上延续了生命。当然，这个说法有点突出人类为了得到智慧果而与God争斗的意味：)

1958年诺贝尔奖获得者Joshua Lederberg发现在bacteria里,存在一种很有意思的现象,一条染色体上的两个同源臂,可以在分裂的时候互相交换,就是发生了同源重组.(Homologous recombination)通俗的说,就是一条拉链的两边在拉动的时候,左边的部分被置换到右边.这样,一些基因信息就发生了交换,如果同源臂上的基因有不同,这样就有可能产生有意义的变异(mutation).这个原理后来人们发现也可以应用到真核生物里,就是高等的生物中也存在这样的现象.那么显然,如果要特异性的在某个染色体区段置换入一个基因,就必需知道置入区域两端的染色体组成,然后在被置入的基因两端也加上相同的组成,这样在重组酶的作用下,就会发生外源基因特异性的代换.

 如上图示意,在染色体进一步复制过程中,蓝色部分被逐渐置换入绿色的区域.整个过程还是比较复杂的。但是具体应用起来,可以用下面的图来示意.

两边的橙色同源成分必须严格一致,这样含有外源基因的target vector在转入ES细胞后,经过重组,就可以把想要改造的基因进行置换了。

这样看上去已经完成了,但是在实际操作中,由于重组发生的效率以及转染可能存在的差异,必须有一个好的选择标记. 并且在选择压力存在之下，重组也才会更有效率.Capecchi以及Oliver Smithies首次在这个系统内用了neo以及tk的双重筛选。也就是，只有在新霉素正筛选以及胸腺嘧啶激酶的负筛选下,得到的克隆才是真正发生了重组有意义的克隆...

巴拉巴拉这么些，看得出科学工作的精妙以及繁琐细致了吧.到上面为止,真正的targetting技术才得到蓬勃的应用和发展,此后相继出现的conditional KO以及Knock in技术无非都是based on上面的进一步发展.